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I sistemi lab-on-a-chip con funzionalità in loco offrono il potenziale per una diagnosi rapida e accurata e sono utili in contesti con risorse limitate in cui non sono disponibili apparecchiature biomediche e professionisti qualificati.Tuttavia, la creazione di un sistema di test point-of-care che abbia contemporaneamente tutte le caratteristiche necessarie per l'erogazione multifunzionale, il rilascio su richiesta, prestazioni affidabili e conservazione a lungo termine dei reagenti rimane una sfida importante.Qui descriviamo una tecnologia di microinterruttori di corsa azionati da leva in grado di manipolare i fluidi in qualsiasi direzione, fornire una risposta precisa e proporzionale alla pressione dell'aria applicata e rimanere stabile contro movimenti e vibrazioni improvvisi.Sulla base della tecnologia, descriviamo anche lo sviluppo di un sistema di reazione a catena della polimerasi che integra le funzioni di introduzione, miscelazione e reazione dei reagenti in un unico processo, che realizza prestazioni "campione in risposta" per tutti i campioni nasali clinici di 18 pazienti con Influenza e 18 controlli individuali, in buona concordanza dell'intensità della fluorescenza con la reazione a catena della polimerasi standard (coefficienti di Pearson > 0,9).Sulla base della tecnologia, descriviamo anche lo sviluppo di un sistema di reazione a catena della polimerasi che integra le funzioni di introduzione, miscelazione e reazione dei reagenti in un unico processo, che realizza prestazioni "campione in risposta" per tutti i campioni nasali clinici di 18 pazienti con influenza e 18 controlli individuali, in buona concordanza dell'intensità della fluorescenza con la reazione a catena della polimerasi standard (coefficienti di Pearson > 0,9).Основываясь на этой технологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет функции введения реагентов, смешивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-ответ-выход» для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов с Грипп e 18 controlli aggiuntivi con la migliore intensità di fluorescenza secondo la reazione polimerica standard цией (коэффициенты Пирсона> 0,9).Sulla base di questa tecnologia, descriviamo anche lo sviluppo di un sistema di reazione a catena della polimerasi che combina le funzioni di iniezione, miscelazione e reazione in un unico processo, consentendo il campionamento in risposta per tutti i campioni nasali clinici di 18 pazienti affetti da influenza.e 18 controlli individuali, in buon accordo con l'intensità di fluorescenza standard della reazione a catena della polimerasi (coefficienti di Pearson > 0,9).Sulla base di questa tecnologia, descriviamo anche lo sviluppo di un sistema di reazione a catena della polimerasi che integra le funzioni di iniezione, miscelazione e reazione dei reagenti per analizzare tutti i campioni nasali clinici provenienti da 18 campioni nasali di pazienti presenti nel campione. Influenza e 18 controlli individuali, intensità di fluorescenza abbinata bene con la reazione a catena della polimerasi standard (coefficiente di Pearson > 0,9).La piattaforma proposta garantisce un'automazione affidabile dell'analisi biomedica e può quindi accelerare la commercializzazione di una gamma di dispositivi di test point-of-care.
Le malattie umane emergenti, come la pandemia di COVID-19 del 2020 che ha causato la morte di milioni di persone, rappresentano una seria minaccia per la salute globale e la civiltà umana1.Il rilevamento precoce, rapido e accurato delle malattie è fondamentale per controllare la diffusione del virus e migliorare i risultati del trattamento.Un ecosistema diagnostico fondamentale basato su laboratori centralizzati in cui i campioni di analisi vengono inviati a ospedali o cliniche diagnostiche e gestiti da professionisti sta attualmente limitando l’accesso a quasi 5,8 miliardi di persone in tutto il mondo, in particolare coloro che vivono in contesti con risorse limitate.dove mancano costose attrezzature biomediche e specialisti qualificati.medici 2. Pertanto, esiste un urgente bisogno di sviluppare un sistema lab-on-a-chip poco costoso e facile da usare con funzionalità di test point-of-care (POCT) in grado di fornire ai medici informazioni diagnostiche tempestive per prendere decisioni diagnostiche informate .e trattamento 3.
Le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) affermano che un POCT ideale dovrebbe essere conveniente, facile da usare (facile da usare con una formazione minima), accurato (evita falsi negativi o falsi positivi), veloce e affidabile (fornisce buone proprietà di ripetibilità) e consegnabile (capace di conservazione a lungo termine e prontamente disponibile per gli utenti finali)4.Per soddisfare questi requisiti, i sistemi POCT devono fornire le seguenti caratteristiche: dosaggio versatile per ridurre l'intervento manuale, rilascio su richiesta su scala, trasporto dei reagenti per risultati di test accurati e prestazioni affidabili per resistere alle vibrazioni ambientali.Attualmente, il dispositivo POCT più utilizzato è la striscia a flusso laterale5,6 costituita da diversi strati di membrane porose di nitrocellulosa che spingono in avanti una quantità molto piccola di campione, reagendo con i reagenti pre-immobilizzati mediante forza capillare.Sebbene abbiano il vantaggio del basso costo, della facilità d'uso e dei risultati rapidi, i dispositivi POCT basati su strisce di flusso possono essere utilizzati solo per test biologici (ad esempio test del glucosio7,8 e test di gravidanza9,10) senza richiedere analisi in più fasi.reazioni (ad esempio caricamento di più reagenti, miscelazione, multiplexing).Inoltre, le forze motrici che controllano il movimento del fluido (ovvero, le forze capillari) non forniscono una buona coerenza, soprattutto tra lotti, con conseguente scarsa riproducibilità11 e rendendo le bande di flusso laterali principalmente utili per un buon rilevamento12,13.
Le capacità di produzione ampliate su scala micro e nanometrica hanno creato opportunità per lo sviluppo di dispositivi POCT microfluidici per misurazioni quantitative14,15,16,17.Regolando le proprietà dell'interfaccia 18, 19 e la geometria dei canali 20, 21, 22, è possibile controllare la forza capillare e la portata di questi dispositivi.Tuttavia, la loro affidabilità, soprattutto per liquidi altamente bagnati, rimane inaccettabile a causa di imprecisioni di produzione, difetti dei materiali e sensibilità alle vibrazioni ambientali.Inoltre, poiché viene creato un flusso capillare nell'interfaccia liquido-gas, non è possibile introdurre alcun flusso aggiuntivo, soprattutto dopo aver riempito il canale microfluidico con liquido.Pertanto, per un rilevamento più complesso, è necessario eseguire diverse fasi di iniezione del campione24,25.
Tra i dispositivi microfluidici, i dispositivi microfluidici centrifughi sono attualmente una delle migliori soluzioni per POCT26,27.Il suo meccanismo di azionamento è vantaggioso in quanto la forza motrice può essere controllata regolando la velocità di rotazione.Lo svantaggio, tuttavia, è che la forza centrifuga è sempre diretta verso il bordo esterno del dispositivo, rendendo difficile l'implementazione delle reazioni a più fasi necessarie per analisi più complesse.Sebbene per il dosaggio multifunzionale vengano introdotte forze motrici aggiuntive (ad es. capillari 28, 29 e molti altri 30, 31, 32, 33, 34, 35) oltre alla forza centrifuga, può comunque verificarsi un trasferimento di liquido imprevisto poiché queste forze aggiuntive sono generalmente dell'ordine di di grandezza inferiore alla forza centrifuga, rendendoli efficaci solo su campi operativi ridotti o non disponibili su richiesta con rilascio di liquido.L'integrazione delle manipolazioni pneumatiche nella microfluidica centrifuga come i metodi cinetici centrifughi 36, 37, 38, i metodi termopneumatici 39 e i metodi pneumatici attivi 40 si è rivelata un'alternativa interessante.Con l'approccio controfugodinamico, nel dispositivo sono integrati una cavità aggiuntiva e microcanali di collegamento per l'azione sia esterna che interna, sebbene la sua efficienza di pompaggio (nell'intervallo dal 75% al 90%) dipenda fortemente dal numero di cicli di pompaggio e dalla viscosità del liquido.Nel metodo termopneumatico, la membrana in lattice e la camera di trasferimento del fluido sono progettate specificatamente per sigillare o riaprire l'ingresso quando il volume d'aria intrappolato viene riscaldato o raffreddato.Tuttavia, la configurazione di riscaldamento/raffreddamento introduce problemi di risposta lenta e ne limita l'uso nei test termosensibili (ad esempio, amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)).Con un approccio pneumatico attivo, il rilascio su richiesta e il movimento verso l'interno sono ottenuti attraverso l'applicazione simultanea di pressione positiva e velocità di rotazione perfettamente abbinate da motori ad alta velocità.Esistono altri approcci di successo che utilizzano solo attuatori pneumatici (pressione positiva 41, 42 o pressione negativa 43) e modelli di valvole normalmente chiuse.Applicando successivamente pressione nella camera pneumatica, il liquido viene pompato in avanti peristalticamente e la valvola normalmente chiusa impedisce il riflusso del liquido dovuto alla peristalsi, realizzando così complesse operazioni con il liquido.Tuttavia, attualmente esiste solo un numero limitato di tecnologie microfluidiche in grado di eseguire operazioni liquide complesse in un singolo dispositivo POCT, tra cui erogazione multifunzionale, rilascio su richiesta, prestazioni affidabili, conservazione a lungo termine, gestione di liquidi ad alta viscosità, e una produzione economicamente vantaggiosa.Tutto allo stesso tempo.La mancanza di un'operazione funzionale in più fasi può anche essere uno dei motivi per cui fino ad oggi solo pochi prodotti POCT commerciali come Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat e Rhonda sono stati introdotti con successo sul mercato aperto.
In questo articolo proponiamo un attuatore microfluidico pneumatico basato sulla tecnologia dei microinterruttori ad anello verde (FAST).FAST combina contemporaneamente tutte le proprietà necessarie per un'ampia gamma di reagenti dai microlitri ai millilitri.FAST è costituito da membrane elastiche, leve e blocchi.Senza l'applicazione della pressione dell'aria, le membrane, le leve e i blocchi possono essere chiusi ermeticamente e il liquido all'interno può essere conservato a lungo.Quando viene applicata una pressione adeguata e regolata in base alla lunghezza della leva, il diaframma si espande e spinge la leva in posizione aperta, consentendo il passaggio del fluido.Ciò consente il dosaggio multifunzionale dei liquidi in cascata, simultaneo, sequenziale o selettivo.
Abbiamo sviluppato un sistema PCR utilizzando FAST per generare risultati di risposta nel campione per il rilevamento dei virus dell'influenza A e B (IAV e IBV).Abbiamo raggiunto un limite inferiore di rilevamento (LOD) di 102 copie/ml, il nostro test multiplex ha mostrato specificità per IAV e IBV e ha consentito la patotipizzazione del virus dell'influenza.I risultati dei test clinici utilizzando il campione di tampone nasale di 18 pazienti e 18 individui sani mostrano una buona concordanza nell'intensità della fluorescenza con RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).I risultati dei test clinici utilizzando il campione di tampone nasale di 18 pazienti e 18 individui sani mostrano una buona concordanza nell'intensità della fluorescenza con RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).Risultati dell'assistenza clinica con l'utilizzo di una maschera medica da parte di 18 pazienti e 18 pazienti affetti da malattie si ottiene un livello elevato di intensità di fluorescenza secondo lo standard OT-ПЦР (nutrienti Pirson > 0,9).I risultati degli studi clinici utilizzando un campione di tampone nasale di 18 pazienti e 18 individui sani mostrano un buon accordo tra l'intensità della fluorescenza della RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).0,9）。。。。。。。。 。 Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 здоровых лиц показали хорошее соответствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).I risultati degli studi clinici utilizzando campioni di tampone nasale di 18 pazienti e 18 individui sani hanno mostrato un buon accordo tra l'intensità della fluorescenza e la RT-PCR standard (coefficiente di Pearson > 0,9).Il costo materiale stimato di un dispositivo FAST-POCT è di circa 1 dollaro USA (Tabella supplementare 1) e può essere ulteriormente ridotto utilizzando metodi di produzione su larga scala (ad esempio stampaggio a iniezione).Infatti, i dispositivi POCT basati su FAST hanno tutte le caratteristiche necessarie richieste dall'OMS e sono compatibili con i nuovi metodi di test biochimici come il ciclo termico del plasma44, i test immunologici senza amplificazione45 e i test di funzionalizzazione dei nanocorpo46 che costituiscono la spina dorsale dei sistemi POCT.possibilità.
Nella fig.1a mostra la struttura della piattaforma FAST-POCT, che consiste di quattro camere per i liquidi: una camera di pre-stoccaggio, una camera di miscelazione, una camera di reazione e una camera dei rifiuti.La chiave per il controllo del flusso del fluido è il design FAST (costituito da membrane elastiche, leve e blocchi) situato nella camera di pre-stoccaggio e nella camera di miscelazione.Essendo un metodo ad azionamento pneumatico, il design FAST fornisce un controllo preciso del flusso del fluido, inclusa la commutazione chiuso/aperto, dosaggio versatile, rilascio del fluido su richiesta, funzionamento affidabile (ad esempio, insensibilità alle vibrazioni ambientali) e conservazione a lungo termine.La piattaforma FAST-POCT è composta da quattro strati: uno strato di supporto, uno strato di pellicola elastica, uno strato di pellicola plastica e uno strato di copertura, come mostrato in una vista ingrandita in Fig. 1b (mostrato anche in dettaglio nelle Figure supplementari S1 e S2 ).Tutti i canali e le camere di trasporto dei fluidi (come le camere di pre-stoccaggio e di reazione) sono incorporati in substrati di PLA (acido polilattico) con uno spessore compreso tra 0,2 mm (la parte più sottile) e 5 mm.Il materiale della pellicola elastica è un PDMS di 300 µm di spessore che si espande facilmente quando viene applicata la pressione dell'aria grazie al suo “spessore sottile” e al basso modulo di elasticità (circa 2,25 MPa47).Lo strato di film di polietilene è realizzato in polietilene tereftalato (PET) con uno spessore di 100 µm per proteggere il film elastico da un'eccessiva deformazione dovuta alla pressione dell'aria.In corrispondenza delle camere, lo strato di substrato è dotato di leve collegate allo strato di copertura (in PLA) tramite cerniere per controllare il flusso del liquido.La pellicola elastica è stata incollata allo strato di supporto mediante nastro biadesivo (ARseal 90880) e ricoperta con una pellicola di plastica.Tre strati sono stati assemblati su un substrato utilizzando un design con clip a T nello strato di copertura.Il morsetto a T ha uno spazio tra due gambe.Quando la clip è stata inserita nella scanalatura, le due gambe si sono piegate leggermente, quindi sono tornate al loro stato originale e hanno legato saldamente il coperchio e il supporto mentre passavano attraverso la scanalatura (Figura complementare S1).I quattro strati vengono poi assemblati tramite connettori.
Rappresentazione schematica della piattaforma che illustra i vari compartimenti funzionali e le caratteristiche di FAST.b Schema ingrandito della piattaforma FAST-POCT.c Foto della piattaforma accanto a una moneta da un quarto di dollaro statunitense.
Il meccanismo di funzionamento della piattaforma FAST-POCT è mostrato nella Figura 2. I componenti chiave sono i blocchi sullo strato di base e le cerniere sullo strato di copertura, che si traduce in un progetto di interferenza quando i quattro strati vengono assemblati utilizzando una forma a T .Quando non viene applicata pressione dell'aria (fig. 2a), l'accoppiamento con interferenza provoca la flessione e la deformazione della cerniera e viene applicata una forza di tenuta attraverso la leva per premere la pellicola elastica contro il blocco e il liquido nella cavità di tenuta viene definito come uno stato sigillato.Da notare che in questo stato la leva è piegata verso l'esterno, come mostrato nella vista laterale di Fig. 2a.Quando viene fornita aria (Fig. 2b), la membrana elastica si espande verso l'esterno verso il coperchio e spinge la leva verso l'alto, aprendo così uno spazio tra la leva e il blocco affinché il fluido possa fluire nella camera successiva, che viene definita come uno stato aperto .Dopo il rilascio della pressione dell'aria, la leva può tornare nella sua posizione originale e rimanere tesa grazie all'elasticità della cerniera.I video dei movimenti della leva sono presentati nel filmato supplementare S1.
A. Schema e fotografie quando chiuso.In assenza di pressione, la leva preme la membrana contro il blocco e il liquido viene sigillato.bIn buone condizioni.Quando viene applicata la pressione, la membrana si espande e spinge la leva verso l'alto, in modo che il canale si apra e il fluido possa fluire.c Determinare la dimensione caratteristica della pressione critica.Tra le dimensioni caratteristiche rientrano la lunghezza della leva (L), la distanza tra cursore e cerniera (l) e lo spessore della sporgenza della leva (t).Fs è la forza di compattazione nel punto di strozzamento B. q è il carico uniformemente distribuito sulla leva.Tx* rappresenta la coppia sviluppata dalla leva incernierata.La pressione critica è la pressione necessaria per sollevare la leva e far fluire il fluido.d Risultati teorici e sperimentali della relazione tra pressione critica e dimensione dell'elemento.Sono stati eseguiti n = 6 esperimenti indipendenti e i dati sono mostrati come ± deviazione standard.I dati grezzi vengono presentati come file di dati grezzi.
È stato sviluppato un modello analitico basato sulla teoria della trave per analizzare la dipendenza della pressione critica Pc alla quale si apre il gap dai parametri geometrici (ad esempio L è la lunghezza della leva, l è la distanza tra il blocco e il cerniera, S è la leva L'area di contatto con il liquido t è lo spessore della sporgenza della leva, come mostrato in Fig. 2c).Come dettagliato nelle note supplementari e nella figura supplementare S3, il divario si apre quando \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), dove Fs è la coppia \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) per eliminare le forze associate ad un adattamento con interferenza e causare la flessione della cerniera.La risposta sperimentale e il modello analitico mostrano un buon accordo (Fig. 2d), mostrando che la pressione critica Pc aumenta con l'aumento di t/l e la diminuzione di L, il che è facilmente spiegato dal modello classico della trave, ovvero la coppia aumenta con t /Lift .Pertanto, la nostra analisi teorica mostra chiaramente che la pressione critica può essere efficacemente controllata regolando la lunghezza della leva L e il rapporto t/l, il che fornisce una base importante per la progettazione della piattaforma FAST-POCT.
La piattaforma FAST-POCT fornisce un'erogazione multifunzionale (mostrata nella Figura 3a con inserto ed esperimento), che è la caratteristica più importante di un POCT di successo, in cui i fluidi possono fluire in qualsiasi direzione e in qualsiasi ordine (a cascata, simultaneo, sequenziale) o multicanale selettivo erogazione.– funzione di dosaggio.Nella fig.3a(i) mostra una modalità di dosaggio a cascata in cui due o più camere sono collegate in cascata utilizzando blocchi per separare i vari reagenti e una leva per controllare gli stati aperto e chiuso.Quando viene applicata la pressione, il liquido scorre a cascata dalla camera superiore a quella inferiore.Va notato che le camere a cascata possono essere riempite con prodotti chimici umidi o chimici secchi come polveri liofilizzate.Nell'esperimento di Fig. 3a(i), l'inchiostro rosso della camera superiore scorre insieme alla polvere colorante blu (solfato di rame) nella seconda camera e diventa blu scuro quando raggiunge la camera inferiore.Mostra anche la pressione di controllo del fluido pompato.Allo stesso modo, quando una leva è collegata a due camere, diventa la modalità di iniezione simultanea, come mostrato in fig.3a(ii), in cui il liquido può essere distribuito uniformemente su due o più camere quando viene applicata la pressione.Poiché la pressione critica dipende dalla lunghezza della leva, la lunghezza della leva può essere regolata per ottenere uno schema di iniezione sequenziale come mostrato in fig.3a(iii).Una leva lunga (con pressione critica Pc_long) è stata collegata alla camera B e una leva corta (con pressione critica Pc_short > Pc_long) è stata collegata alla camera A. Poiché è stata applicata la pressione P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo il liquido in rosso può fluire nella camera B e quando la pressione è stata aumentata a P2 (> Pc_short), il liquido blu può fluire nella camera A. Questa modalità di iniezione sequenziale si applica a diversi liquidi che si trasferiscono in sequenza nelle relative camere, il che è fondamentale per un POCT di successo dispositivo.Una leva lunga (con pressione critica Pc_long) è stata collegata alla camera B e una leva corta (con pressione critica Pc_short > Pc_long) è stata collegata alla camera A. Poiché è stata applicata la pressione P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), solo il liquido in rosso può fluire nella camera B e quando la pressione è stata aumentata a P2 (> Pc_short), il liquido blu può fluire nella camera A. Questa modalità di iniezione sequenziale si applica a diversi liquidi che si trasferiscono in sequenza nelle relative camere, il che è fondamentale per un POCT di successo dispositivo.Д§ ный ычаг (с к кическиuter давлением pc_long) ы iscoro ыл сèi оинеbito оединен с камерой A. пр приложении давления P1 (pc_long
a Illustrazione dell'assegnazione multifunzionale, ovvero (i) assegnazione a cascata, (ii) simultanea, (iii) sequenziale e (iv) assegnazione selettiva.Le curve rappresentano il flusso di lavoro e i parametri di queste quattro modalità di distribuzione.b Risultati dei test di conservazione a lungo termine in acqua deionizzata ed etanolo.Sono stati eseguiti n = 5 esperimenti indipendenti e i dati sono mostrati come ± sd c.Dimostrazioni di test di stabilità quando il dispositivo FAST e il dispositivo con valvola capillare (CV) erano in (i) stati statici e (ii) vibranti.(iii) Volume rispetto al tempo per dispositivi FAST e CV a varie frequenze angolari.d Pubblicazione dei risultati dei test su richiesta per (i) dispositivo FAST e (ii) dispositivo CV.(iii) Relazione tra volume e tempo per dispositivi FAST e CV che utilizzano la modalità di pressione intermittente.Tutte le barre della scala, 1 cm.I dati grezzi vengono forniti come file di dati grezzi.
La conservazione a lungo termine dei reagenti è un'altra caratteristica importante di un dispositivo POCT di successo che consentirà al personale non addestrato di gestire più reagenti.Sebbene molte tecnologie abbiano dimostrato il loro potenziale per la conservazione a lungo termine (ad esempio, 35 microdispenser, 48 blister e 49 stick pack), è necessario uno scomparto di ricezione dedicato per accogliere la confezione, il che aumenta i costi e la complessità;inoltre, questi meccanismi di conservazione non consentono la dispensazione su richiesta e comportano uno spreco di reagenti a causa dei residui nella confezione.La capacità di conservazione a lungo termine è stata verificata eseguendo un test di vita accelerato utilizzando materiale PMMA lavorato a CNC a causa della sua leggera rugosità e resistenza alla permeazione del gas (Figura supplementare S5).L'apparato di prova è stato riempito con acqua deionizzata (acqua deionizzata) ed etanolo al 70% (simulando reagenti volatili) a 65°C per 9 giorni.Sia l'acqua deionizzata che l'etanolo sono stati conservati utilizzando un foglio di alluminio per bloccare l'accesso dall'alto.Per calcolare l’equivalente in tempo reale sono state utilizzate l’equazione di Arrhenius e l’energia di attivazione della penetrazione riportate in letteratura50,51.Nella fig.3b mostra i risultati della perdita di peso media per 5 campioni conservati a 65°C per 9 giorni, equivalenti allo 0,30% per acqua deionizzata e allo 0,72% per etanolo al 70% in 2 anni a 23°C.
Nella fig.3c mostra il test di vibrazione.Poiché la valvola capillare (CV) è il metodo di gestione dei fluidi più popolare tra i dispositivi POCT28,29 esistenti, per il confronto è stato utilizzato un dispositivo CV largo 300 µm e profondo 200 µm.Si può vedere che quando entrambi i dispositivi rimangono fermi, il fluido nella piattaforma FAST-POCT si sigilla e il fluido nel dispositivo CV si blocca a causa dell'improvvisa espansione del canale, che riduce le forze capillari.Tuttavia, all'aumentare della frequenza angolare del vibratore orbitale, il fluido nella piattaforma FAST-POCT rimane sigillato, ma il fluido nel dispositivo CV scorre nella camera inferiore (vedi anche Filmato Supplementare S3).Ciò suggerisce che le cerniere deformabili della piattaforma FAST-POCT possono applicare una forte forza meccanica al modulo per chiudere ermeticamente il liquido nella camera.Tuttavia, nei dispositivi CV, il liquido viene trattenuto a causa dell'equilibrio tra le fasi solida, aria e liquida, creando instabilità e le vibrazioni possono alterare l'equilibrio e causare un comportamento del flusso inaspettato.Il vantaggio della piattaforma FAST-POCT è che fornisce funzionalità affidabili ed evita guasti in presenza di vibrazioni che solitamente si verificano durante la consegna e il funzionamento.
Un'altra caratteristica importante della piattaforma FAST-POCT è il suo rilascio su richiesta, che è un requisito fondamentale per l'analisi quantitativa.Nella fig.3d confronta il rilascio on-demand della piattaforma FAST-POCT e del dispositivo CV.Dalla fig.3d(iii) vediamo che il dispositivo FAST risponde rapidamente al segnale di pressione.Quando la pressione è stata applicata alla piattaforma FAST-POCT, il fluido scorreva, quando la pressione veniva rilasciata, il flusso si interrompeva immediatamente (Fig. 3d (i)).Questa azione si spiega con il rapido ritorno elastico della cerniera, che preme nuovamente la leva contro il blocco, chiudendo la camera.Tuttavia, il fluido ha continuato a fluire nel dispositivo CV, risultando infine in un volume di fluido inaspettato di circa 100 µl dopo il rilascio della pressione (Figura 3d(ii) e Filmato Supplementare S4).Ciò può essere spiegato dalla scomparsa dell'effetto di blocco capillare dopo la completa bagnatura del CV dopo la prima iniezione.
La capacità di gestire liquidi di varia bagnabilità e viscosità nello stesso dispositivo rimane una sfida per le applicazioni POCT.Una scarsa bagnabilità può portare a perdite o ad altri comportamenti inattesi del flusso nei canali e per preparare liquidi altamente viscosi sono spesso necessarie apparecchiature ausiliarie come miscelatori a vortice, centrifughe e filtri 52 .Abbiamo testato la relazione tra pressione critica e proprietà del fluido (con un ampio intervallo di bagnabilità e viscosità).I risultati sono mostrati nella Tabella 1 e nel Video S5.Si può vedere che liquidi di diversa bagnabilità e viscosità possono essere sigillati nella camera e, quando viene applicata la pressione, anche liquidi con una viscosità fino a 5500 cP possono essere trasferiti nella camera adiacente, rendendo possibile il rilevamento di campioni con elevata viscosità (cioè espettorato, un campione molto viscoso utilizzato per la diagnosi delle malattie respiratorie).
Combinando i suddetti dispositivi di distribuzione multifunzionali, è possibile sviluppare un'ampia gamma di dispositivi POCT basati su FAST.Un esempio è mostrato nella Figura 1. L'impianto contiene una camera di pre-stoccaggio, una camera di miscelazione, una camera di reazione e una camera dei rifiuti.I reagenti possono essere conservati nella camera di pre-stoccaggio per lunghi periodi di tempo e quindi scaricati nella camera di miscelazione.Con la giusta pressione, i reagenti miscelati possono essere trasferiti selettivamente in una camera di scarico o in una camera di reazione.
Poiché il rilevamento PCR è il gold standard per il rilevamento di agenti patogeni come H1N1 e COVID-19 e prevede più fasi di reazione, abbiamo utilizzato la piattaforma FAST-POCT per il rilevamento PCR come applicazione.Nella fig.4 mostra il processo di test PCR utilizzando la piattaforma FAST-POCT.Innanzitutto, il reagente di eluizione, il reagente con microsfere magnetiche, la soluzione di lavaggio A e la soluzione di lavaggio W sono stati pipettati rispettivamente nelle camere di pre-stoccaggio E, M, W1 e W2.Le fasi dell'adsorbimento dell'RNA sono mostrate in fig.4a e sono le seguenti: (1) quando viene applicata la pressione P1 (=0,26 bar), il campione si sposta nella camera M e viene scaricato nella camera di miscelazione.(2) La pressione dell'aria P2 (= 0,12 bar) è fornita attraverso la porta A collegata al fondo della camera di miscelazione.Sebbene numerosi metodi di miscelazione abbiano dimostrato il loro potenziale nella miscelazione di liquidi su piattaforme POCT (ad esempio miscelazione a serpentina 53, miscelazione casuale 54 e miscelazione batch 55), la loro efficienza ed efficacia di miscelazione non sono ancora soddisfacenti.Adotta il metodo di miscelazione a bolle, in cui l'aria viene introdotta sul fondo della camera di miscelazione per creare bolle nel liquido, dopodiché il potente vortice può raggiungere la miscelazione completa in pochi secondi.Sono stati condotti esperimenti di miscelazione delle bolle e i risultati sono presentati nella Figura supplementare S6.Si può notare che applicando una pressione di 0,10 bar la miscelazione completa impiega circa 8 secondi.Aumentando la pressione a 0,20 bar si ottiene la miscelazione completa in circa 2 secondi.I metodi per calcolare l'efficienza di miscelazione sono presentati nella sezione Metodi.(3) Utilizzare un magnete al rubidio per estrarre le sfere, quindi pressurizzare P3 (= 0,17 bar) attraverso la porta P per spostare i reagenti nella camera dei rifiuti.Nella fig.4b,c mostra le fasi di lavaggio per rimuovere le impurità dal campione come segue: (1) La soluzione di lavaggio A dalla camera W1 viene scaricata nella camera di miscelazione a pressione P1.(2) Quindi eseguire il processo di miscelazione delle bolle.(3) La soluzione di lavaggio A viene trasferita nella camera dei liquidi di scarto e le microsfere nella camera di miscelazione vengono estratte dal magnete.Il lavaggio W (Fig. 4c) era simile al lavaggio A (Fig. 4b).È da notare che ciascuna fase di lavaggio A e W è stata eseguita due volte.La Figura 4d mostra le fasi di eluizione per eluire l'RNA dalle sfere;le fasi di introduzione di eluizione e miscelazione sono le stesse delle fasi di adsorbimento e lavaggio dell'RNA descritte sopra.Quando i reagenti di eluizione vengono trasferiti nella camera di reazione PCR alle pressioni P3 e P4 (=0,23 bar), viene raggiunta la pressione critica per sigillare il braccio della camera di reazione PCR.Allo stesso modo, la pressione P4 aiuta anche a sigillare il passaggio verso la camera dei rifiuti.Pertanto, tutti i reagenti di eluizione sono stati distribuiti uniformemente tra le quattro camere di reazione PCR per avviare le reazioni PCR multiplex.La procedura di cui sopra è presentata nel filmato supplementare S6.
Nella fase di adsorbimento dell'RNA, il campione viene introdotto nell'ingresso M e iniettato nella camera di miscelazione insieme alla soluzione di sfere precedentemente conservata.Dopo aver miscelato e rimosso i granuli, i reagenti vengono distribuiti nella camera dei rifiuti.Nelle fasi di lavaggio b e c, introdurre vari reagenti di lavaggio pre-conservati nella camera di miscelazione e, dopo aver miscelato e rimosso le sfere, trasferire i reagenti nella camera dei liquidi di scarto.d Fase di eluizione: dopo aver introdotto i reagenti di eluizione, miscelazione ed estrazione delle sfere, i reagenti vengono trasferiti nella camera di reazione PCR.Le curve mostrano il flusso di lavoro e i relativi parametri delle varie fasi.La pressione è la pressione esercitata attraverso le singole camere.Il volume è il volume del liquido nella camera di miscelazione.Tutte le barre della scala sono 1 cm.I dati grezzi vengono forniti come file di dati grezzi.
È stata eseguita una procedura di test PCR e la Figura supplementare S7 presenta profili termici che includono 20 minuti di tempo di trascrizione inversa e 60 minuti di tempo di ciclo termico (95 e 60 ° C), con un ciclo termico di 90 s (filmato supplementare S7)..FAST-POCT richiede meno tempo per completare un ciclo termico (90 secondi) rispetto alla RT-PCR convenzionale (180 secondi per un ciclo termico).Ciò può essere spiegato dall'elevato rapporto superficie/volume e dalla bassa inerzia termica della camera di reazione micro-PCR.La superficie della camera è di 96,6 mm2 e il volume della camera è di 25 mm3, per un rapporto superficie/volume di circa 3,86.Come visto nella Figura supplementare S10, l'area del test PCR della nostra piattaforma presenta una scanalatura sul pannello posteriore, che rende il fondo della camera PCR spesso 200 µm.Un cuscinetto elastico termicamente conduttivo è fissato alla superficie riscaldante del termoregolatore, garantendo uno stretto contatto con il retro della scatola di prova.Ciò riduce l'inerzia termica della piattaforma e migliora l'efficienza di riscaldamento/raffreddamento.Durante il ciclo termico, la paraffina incorporata nella piattaforma si scioglie e scorre nella camera di reazione PCR, agendo come sigillante per prevenire l'evaporazione dei reagenti e la contaminazione ambientale (vedere Filmato Supplementare S8).
Tutti i processi di rilevamento PCR sopra descritti sono stati completamente automatizzati utilizzando uno strumento FAST-POCT personalizzato, costituito da un'unità di controllo della pressione programmata, un'unità di estrazione magnetica, un'unità di controllo della temperatura e un'unità di acquisizione ed elaborazione del segnale fluorescente.Da notare che abbiamo utilizzato la piattaforma FAST-POCT per l'isolamento dell'RNA e quindi utilizzato i campioni di RNA estratti per le reazioni PCR utilizzando il sistema FAST-POCT e il sistema PCR desktop per il confronto.I risultati erano quasi gli stessi mostrati nella Figura supplementare S8.L'operatore esegue un compito semplice: introduce il campione nella camera M e inserisce la piattaforma nello strumento.I risultati dei test quantitativi sono disponibili in circa 82 minuti.Informazioni dettagliate sugli strumenti FAST-POCT sono disponibili nella figura supplementare.C9, C10 e C11.
L’influenza causata dai virus influenzali A (IAV), B (IBV), C (ICV) e D (IDV) è un fenomeno globale comune.Di questi, IAV e IBV sono responsabili dei casi più gravi e delle epidemie stagionali, infettando il 5-15% della popolazione mondiale, causando 3-5 milioni di casi gravi e provocando 290.000-650.000 morti ogni anno.Malattie respiratorie56,57.La diagnosi precoce di IAV e IB è essenziale per ridurre la morbilità e l’onere economico associato.Tra le tecniche diagnostiche disponibili, la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è considerata la più sensibile, specifica e accurata (>99%)58,59.Tra le tecniche diagnostiche disponibili, la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è considerata la più sensibile, specifica e accurata (>99%)58,59.Il metodo diagnostico disponibile è la reazione di polimerizzazione con la trascrizione ufficiale (OIT-ПЦР). più nutriente, specifico e tonico (> 99%)58,59.Tra i metodi diagnostici disponibili, la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è considerata la più sensibile, specifica e accurata (> 99%)58,59. A causa del metodo diagnostico disponibile, la reazione di polimerizzazione con l'aiuto del trascrittore (OIT-ПЦР) si trova qui più nutriente, specifico e tonico (>99%)58,59.Tra i metodi diagnostici disponibili, la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è considerata la più sensibile, specifica e accurata (>99%)58,59.Tuttavia, i metodi RT-PCR tradizionali richiedono ripetuti pipettaggi, miscelazioni, dispensazioni e trasferimenti di liquidi, limitandone l'uso da parte di professionisti in contesti con risorse limitate.In questo caso, la piattaforma FAST-POCT è stata utilizzata per il rilevamento tramite PCR di IAV e IBV, rispettivamente, per ottenere il loro limite inferiore di rilevamento (LOD).Inoltre, IAV e IBV sono stati sottoposti a multiplex per discriminare tra diversi patotipi tra le specie, fornendo una piattaforma promettente per l'analisi genetica e la capacità di trattare accuratamente la malattia.
Nella fig.5a mostra i risultati del test PCR HAV utilizzando 150 µl di RNA virale purificato come campione.Nella fig.5a(i) mostra che ad una concentrazione di HAV di 106 copie/ml, l'intensità di fluorescenza (ΔRn) può raggiungere 0,830 e quando la concentrazione viene ridotta a 102 copie/ml, ΔRn può ancora raggiungere 0,365, che corrisponde a un valore superiore a quello del gruppo di controllo negativo vuoto (0,002), circa 100 volte superiore.Per la quantificazione basata su sei esperimenti indipendenti, è stata generata una curva di calibrazione lineare tra la concentrazione logaritmica e la soglia del ciclo (Ct) di IAV (Fig. 5a(ii)), R2 = 0,993, compreso tra 102 e 106 copie/mL.i risultati sono in buon accordo con i metodi RT-PCR convenzionali.Nella fig.5a(iii) mostra immagini fluorescenti dei risultati del test dopo 40 cicli della piattaforma FAST-POCT.Abbiamo scoperto che la piattaforma FAST-POCT è in grado di rilevare l'HAV a partire da 102 copie/mL.Tuttavia, il metodo tradizionale non ha un valore Ct pari a 102 copie/ml, il che lo rende un LOD di circa 103 copie/ml.Abbiamo ipotizzato che ciò possa essere dovuto all'elevata efficienza della miscelazione delle bolle.Sono stati eseguiti esperimenti di test PCR su RNA IAV purificato per valutare vari metodi di miscelazione, tra cui miscelazione con agitazione (stesso metodo di miscelazione utilizzato nell'operazione RT-PCR convenzionale), miscelazione in fiale (questo metodo, 3 s a 0,12 bar) e nessuna miscelazione come gruppo di controllo ..I risultati possono essere trovati nella Figura supplementare S12.Si può vedere che a una concentrazione di RNA più elevata (106 copie/mL), i valori Ct dei diversi metodi di miscelazione sono quasi gli stessi della miscelazione a bolle.Quando la concentrazione di RNA è scesa a 102 copie/mL, la miscela agitata e i controlli non presentavano valori Ct, mentre il metodo della miscelazione a bolle ha comunque fornito un valore Ct di 36,9, che era inferiore alla soglia Ct di 38. I risultati mostrano una caratteristica di miscelazione dominante vescicole, che è stato dimostrato anche in altra letteratura, il che potrebbe anche spiegare perché la sensibilità della piattaforma FAST-POCT è leggermente superiore alla RT-PCR convenzionale.Nella fig.5b mostra i risultati dell'analisi PCR di campioni di RNA di IBV purificati compresi tra 101 e 106 copie/ml.I risultati sono stati simili al test IAV, ottenendo un R2 = 0,994 e un LOD di 102 copie/mL.
un'analisi PCR del virus dell'influenza A (IAV) con concentrazioni di IAV comprese tra 106 e 101 copie/mL utilizzando il tampone TE come controllo negativo (NC).(i) Curva di fluorescenza in tempo reale.(ii) Curva di calibrazione lineare tra la concentrazione logaritmica di RNA IAV e la soglia del ciclo (Ct) per i metodi di test FAST e convenzionali.(iii) Immagine fluorescente IAV FAST-POCT dopo 40 cicli.b, rilevamento tramite PCR del virus dell'influenza B (IBV) con (i) spettro di fluorescenza in tempo reale.(ii) Curva di calibrazione lineare e (iii) Immagine di fluorescenza FAST-POCT IBV dopo 40 cicli.Il limite inferiore di rilevamento (LOD) per IAV e IBV utilizzando la piattaforma FAST-POCT era di 102 copie/ml, ovvero inferiore rispetto ai metodi convenzionali (103 copie/ml).c Risultati dei test multiplex per IAV e IBV.GAPDH è stato utilizzato come controllo positivo e il tampone TE è stato utilizzato come controllo negativo per prevenire possibili contaminazioni e amplificazione di fondo.Si possono distinguere quattro diversi tipi di campioni: (1) campioni negativi solo GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) Infezione da IAV (“IAV+/IBV-”) con IAV e GAPDH;(3) Infezione da IBV (“IAV-/IBV+”) con IBV e GAPDH;(4) Infezione da IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) con IAV, IBV e GAPDH.La linea tratteggiata rappresenta la linea di soglia.Sono stati eseguiti n = 6 esperimenti biologicamente indipendenti, i dati sono mostrati come ± deviazione standard.I dati grezzi vengono presentati come file di dati grezzi.
Nella fig.5c mostra i risultati del test di multiplexing per IAV/IBV.Qui, il lisato virale è stato utilizzato come soluzione campione al posto dell'RNA purificato e quattro primer per IAV, IBV, GAPDH (controllo positivo) e tampone TE (controllo negativo) sono stati aggiunti a quattro diverse camere di reazione della piattaforma FAST-POCT.Qui vengono utilizzati controlli positivi e negativi per prevenire possibili contaminazioni e miglioramenti dello sfondo.I test sono stati divisi in quattro gruppi: (1) campioni GAPDH negativi (“IAV-/IBV-”);(2) infetto da IAV (“IAV+/IBV-”) rispetto a IAV e GAPDH;(3) IBV-.infetto (“IAV-”) -/IBV+”) IBV e GAPDH;(4) Infezione da IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) da IAV, IBV e GAPDH.Nella fig.5c mostra che quando sono stati applicati campioni negativi, l'intensità di fluorescenza ΔRn della camera di controllo positivo era 0,860 e il ΔRn di IAV e IBV era simile al controllo negativo (0,002).Per i gruppi IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ e IAV+/IBV+, le fotocamere IAV/GAPDH, IBV/GAPDH e IAV/IBV/GAPDH hanno mostrato rispettivamente un'intensità di fluorescenza significativa, mentre le altre fotocamere hanno mostrato un'intensità di fluorescenza anche su uno sfondo livello di 40 dopo il ciclo termico.Dai test di cui sopra, la piattaforma FAST-POCT ha mostrato una specificità eccezionale e ci ha permesso di patotipizzare simultaneamente diversi virus influenzali.
Per convalidare l'applicabilità clinica di FAST-POCT, abbiamo testato 36 campioni clinici (campioni di tampone nasale) provenienti da pazienti IB (n = 18) e controlli non IB (n = 18) (Figura 6a).Le informazioni sui pazienti sono presentate nella Tabella supplementare 3. Lo stato di infezione da IB è stato confermato in modo indipendente e il protocollo di studio è stato approvato dal primo ospedale affiliato dell'Università di Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Ciascun campione di pazienti è stato suddiviso in due categorie.Uno è stato elaborato utilizzando FAST-POCT e l'altro è stato elaborato utilizzando un sistema PCR desktop (SLAN-96P, Cina).Entrambi i test utilizzano gli stessi kit di purificazione e rilevamento.Nella fig.6b mostra i risultati di FAST-POCT e PCR a trascrizione inversa convenzionale (RT-PCR).Abbiamo confrontato l'intensità della fluorescenza (FAST-POCT) con -log2(Ct), dove Ct è la soglia del ciclo per la RT-PCR convenzionale.C’è stato un buon accordo tra i due metodi.FAST-POCT e RT-PCR hanno mostrato una forte correlazione positiva con un valore del rapporto di Pearson (r) di 0,90 (Figura 6b).Abbiamo quindi valutato l'accuratezza diagnostica di FAST-POCT.Le distribuzioni dell'intensità della fluorescenza (FL) per i campioni positivi e negativi sono state fornite come misura analitica indipendente (Fig. 6c).I valori FL erano significativamente più alti nei pazienti IB rispetto ai controlli (****P = 3,31 × 10-19; t-test a due code) (Fig. 6d).Successivamente, sono state tracciate le curve delle caratteristiche operative del ricevitore IBV (ROC).Abbiamo riscontrato che l'accuratezza diagnostica era molto buona, con un'area sotto la curva di 1 (Fig. 6e).Si prega di notare che a causa dell'ordinazione obbligatoria di mascherine in Cina a causa del COVID-19 a partire dal 2020, non abbiamo identificato pazienti con IBD, quindi tutti i campioni clinici positivi (ovvero campioni di tampone nasale) erano solo per IBV.
Progettazione dello studio clinico.Un totale di 36 campioni, inclusi 18 campioni di pazienti e 18 controlli non influenzali, sono stati analizzati utilizzando la piattaforma FAST-POCT e la RT-PCR convenzionale.b Valutare la coerenza analitica tra FAST-POCT PCR e RT-PCR convenzionale.I risultati erano correlati positivamente (Pearson r = 0,90).c Livelli di intensità della fluorescenza in 18 pazienti IB e 18 controlli.d Nei pazienti IB (+), i valori FL erano significativamente più alti rispetto al gruppo di controllo (-) (****P = 3,31 × 10-19; test t a due code; n = 36).Per ogni grafico quadrato, l'indicatore nero al centro rappresenta la mediana e le linee inferiore e superiore del riquadro rappresentano rispettivamente il 25° e il 75° percentile.I baffi si estendono ai punti dati minimo e massimo, che non sono considerati valori anomali.e Curva ROC.La linea tratteggiata d rappresenta il valore soglia stimato dall'analisi ROC.L'AUC per IBV è 1. I dati grezzi vengono forniti come file di dati grezzi.
In questo articolo presentiamo FAST, che ha le caratteristiche richieste per un POCT ideale.I vantaggi della nostra tecnologia includono: (1) dosaggio versatile (a cascata, simultaneo, sequenziale e selettivo), rilascio su richiesta (rilascio rapido e proporzionale della pressione applicata) e funzionamento affidabile (vibrazione a 150 gradi) (2) conservazione a lungo termine (2 anni di test accelerati, perdita di peso di circa lo 0,3%);(3) la capacità di lavorare con liquidi con un'ampia gamma di bagnabilità e viscosità (viscosità fino a 5500 cP);(4) Economico (il costo materiale stimato del dispositivo FAST-POCT PCR è di circa 1 dollaro USA).Combinando dispenser multifunzionali, è stata dimostrata e applicata una piattaforma FAST-POCT integrata per il rilevamento tramite PCR dei virus dell'influenza A e B.FAST-POCT richiede solo 82 minuti.I test clinici con 36 campioni di tampone nasale hanno mostrato una buona concordanza nell'intensità della fluorescenza con RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).I test clinici con 36 campioni di tampone nasale hanno mostrato una buona concordanza nell'intensità della fluorescenza con RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).Test clinici con 36 campioni di maschera da noi analizzati secondo i migliori standard di intensità della fluorescenza ной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Test clinici con 36 campioni di tamponi nasali hanno mostrato un buon accordo con l'intensità di fluorescenza della RT-PCR standard (coefficienti di Pearson > 0,9).RT-PCR Istruzione clinica 36 prodotti per la maschera da noi elencati per un'intensificazione dell'intensità della fluorescenza così elevata dartnoй ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).I test clinici su 36 campioni di tampone nasale hanno mostrato un buon accordo dell'intensità della fluorescenza con la RT-PCR standard (coefficiente di Pearson > 0,9).Parallelamente a questo lavoro, vari metodi biochimici emergenti (ad esempio, il ciclo termico del plasma, i test immunologici senza amplificazione e i test di funzionalizzazione dei nanobody) hanno mostrato il loro potenziale nel POCT.Tuttavia, a causa della mancanza di una piattaforma POCT solida e completamente integrata, questi metodi richiedono inevitabilmente procedure di pre-elaborazione separate (ad esempio, isolamento dell'RNA44, incubazione45 e lavaggio46), che integrano ulteriormente il lavoro attuale con questi metodi per implementare funzioni POCT avanzate con i parametri richiesti.prestazioni di recupero dell'output in risposta.In questo lavoro, sebbene la pompa dell'aria utilizzata per attivare la valvola FAST sia sufficientemente piccola da essere integrata in uno strumento da banco (Fig. S9, S10), consuma comunque una quantità significativa di energia e genera rumore.In linea di principio, le pompe pneumatiche con fattore di forma più piccolo possono essere sostituite con altri mezzi, come l’uso della forza elettromagnetica o l’azionamento con le dita.Ulteriori miglioramenti potrebbero includere, ad esempio, l'adattamento di kit per test biochimici diversi e specifici, l'utilizzo di nuovi metodi di rilevamento che non richiedono sistemi di riscaldamento/raffreddamento, fornendo così una piattaforma POCT senza strumenti per le applicazioni PCR.Riteniamo che, dato che la piattaforma FAST fornisce un modo per manipolare i liquidi, riteniamo che la tecnologia FAST proposta presenti il potenziale per creare una piattaforma comune non solo per i test biomedici, ma anche per il monitoraggio ambientale, i test sulla qualità degli alimenti, la sintesi di materiali e farmaci. ..
La raccolta e l'uso di campioni di tamponi nasali umani sono stati approvati dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Zhejiang (IIT20220330B).Sono stati raccolti 36 campioni di tamponi nasali, coinvolgendo 16 adulti < 30 anni, 7 adulti > 40 anni e 19 maschi, 17 femmine.Sono stati raccolti 36 campioni di tamponi nasali, coinvolgendo 16 adulti < 30 anni, 7 adulti > 40 anni e 19 maschi, 17 femmine.Sono stati usati 36 pezzi di maschera per il naso, in cui l'uso principale è stato di 16 minuti < 30 litri, 7 giorni all'anno 40 minuti , 19 persone e 17 donne.Sono stati raccolti trentasei campioni di tamponi nasali da 16 adulti di età < 30 anni, 7 adulti di età superiore ai 40 anni, 19 uomini e 17 donne.I dati demografici sono presentati nella Tabella Supplementare 3. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti.Tutti i partecipanti erano sospettati di avere l'influenza e sono stati testati volontariamente senza alcun compenso.
La base e il coperchio FAST sono realizzati in acido polilattico (PLA) e stampati con la stampante 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Il nastro biadesivo è stato acquistato da adesivi Research, Inc. modello 90880. La pellicola in PET spessa 100 µm è stata acquistata da McMaster-Carr.Sia l'adesivo che la pellicola in PET sono stati tagliati utilizzando la taglierina Silhouette Cameo 2 di Silhouette America, Inc. La pellicola elastica è realizzata in materiale PDMS mediante stampaggio a iniezione.Innanzitutto, un telaio in PET spesso 200 µm è stato tagliato utilizzando un sistema laser e incollato su un foglio di PMMA spesso 3 mm utilizzando nastro biadesivo da 100 µm.Il precursore del PDMS (Sylgard 184; Parte A: Parte B = 10:1, Dow Corning) è stato quindi versato nello stampo ed è stata utilizzata una bacchetta di vetro per rimuovere il PDMS in eccesso.Dopo l'indurimento a 70°C per 3 ore, la pellicola PDMS spessa 300 μm è stata staccata dallo stampo.
Le foto per una distribuzione versatile, la pubblicazione su richiesta e prestazioni affidabili vengono scattate con una fotocamera ad alta velocità (Sony AX700 1000 fps).L'agitatore orbitale utilizzato nel test di affidabilità è stato acquistato da SCILOGEX (SCI-O180).La pressione dell'aria viene generata da un compressore d'aria e per regolare il valore della pressione vengono utilizzati diversi regolatori di pressione digitali di precisione.Il processo di test del comportamento del flusso è il seguente.Una quantità predeterminata di fluido è stata iniettata nel dispositivo di prova ed è stata utilizzata una telecamera ad alta velocità per registrare il comportamento del flusso.Sono state quindi scattate immagini fisse dai video del comportamento del flusso a tempi prestabiliti e l'area rimanente è stata calcolata utilizzando il software Image-Pro Plus, che è stata poi moltiplicata per la profondità della fotocamera per calcolare il volume.I dettagli del sistema di test del comportamento del flusso sono disponibili nella Figura supplementare S4.
Iniettare 50 µl di microsfere e 100 µl di acqua deionizzata nel dispositivo di miscelazione delle fiale.Sono state scattate fotografie con prestazioni miste con una fotocamera ad alta velocità ogni 0,1 secondi a pressioni di 0,1 bar, 0,15 bar e 0,2 bar.Le informazioni sui pixel durante il processo di fusione possono essere ottenute da queste immagini utilizzando un software di elaborazione fotografica (Photoshop CS6).E l'efficienza della miscelazione può essere ottenuta con la seguente equazione 53.
dove M è l'efficienza di miscelazione, N è il numero totale di pixel campione e ci e \(\bar{c}\) sono le concentrazioni normalizzate e previste.L'efficienza di miscelazione varia da 0 (0%, non miscelato) a 1 (100%, completamente miscelato).I risultati sono mostrati nella Figura supplementare S6.
Kit RT-PCR in tempo reale per IAV e IBV, inclusi campioni di RNA di IAV e IBV (cat. n. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Cina), tampone Tris-EDTA (tampone TE n. B541019 , Sangon Biotech, Cina), il kit di purificazione dell'RNA di controllo positivo (codice articolo Z-ME-0010, Liferiver, Cina) e la soluzione GAPDH (codice articolo M591101, Sangon Biotech, Cina) sono disponibili in commercio.Il kit di purificazione dell'RNA include un tampone di legame, lavaggio A, lavaggio W, eluente, microsfere magnetiche e un carrier acrilico.I kit RT-PCR in tempo reale IAV e IBV includono la miscela di rilevamento PCR dell'acido nucleico IFVA e l'enzima RT-PCR.Aggiungere 6 µl di AcrylCarrier e 20 µl di sfere magnetiche a 500 µl di soluzione tampone legante, agitare bene e quindi preparare la soluzione di sfere.Aggiungere 21 ml di etanolo ai lavaggi A e W, agitare bene per ottenere rispettivamente le soluzioni dei lavaggi A e W.Quindi, 18 µl di miscela PCR fluorescente con acido nucleico IFVA e 1 µl di enzima RT-PCR sono stati aggiunti a 1 µl di soluzione TE, agitati e centrifugati per diversi secondi, ottenendo 20 µl di primer IAV e IBV.
Seguire la seguente procedura di purificazione dell'RNA: (1) Adsorbimento dell'RNA.Pipettare 526 µl della soluzione pellet in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e aggiungere 150 µl di campione, quindi agitare manualmente la provetta su e giù per 10 volte.Trasferire 676 µl della miscela nella colonna di affinità e centrifugare a 1,88 x 104 g per 60 secondi.I successivi scarichi vengono poi eliminati.(2) La prima fase del lavaggio.Aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio A alla colonna di affinità, centrifugare a 1,88 x 104 g per 40 s ed eliminare la soluzione esaurita.Questo processo di lavaggio è stato ripetuto due volte.(3) la seconda fase di lavaggio.Aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio W alla colonna di affinità, centrifugare a 1,88×104 g per 15 s ed eliminare la soluzione esaurita.Questo processo di lavaggio è stato ripetuto due volte.(4) Eluizione.Aggiungere 200 µl di eluato alla colonna di affinità e centrifugare a 1,88 x 104 g per 2 minuti.(5) RT-PCR: l'eluato è stato iniettato in 20 μl della soluzione di primer in una provetta per PCR, quindi la provetta è stata posizionata in un apparecchio per test PCR in tempo reale (SLAN-96P) per eseguire il processo RT-PCR.L'intero processo di rilevamento richiede circa 140 minuti (20 minuti per la purificazione dell'RNA e 120 minuti per il rilevamento tramite PCR).
526 µl di soluzione di sferette, 1000 µl di soluzione di lavaggio A, 1000 µl di soluzione di lavaggio W, 200 µl di eluato e 20 µl di soluzione di primer sono stati preliminarmente aggiunti e conservati nelle camere M, W1, W2, E e nelle camere di rilevamento PCR.Assemblaggio della piattaforma.Quindi, 150 µl del campione sono stati pipettati nella camera M e la piattaforma FAST-POCT è stata inserita nello strumento di test mostrato nella Figura supplementare S9.Dopo circa 82 minuti, i risultati del test erano disponibili.
Salvo diversa indicazione, tutti i risultati dei test sono presentati come media ± DS dopo un minimo di sei repliche utilizzando solo la piattaforma FAST-POCT e campioni biologicamente indipendenti.Nessun dato è stato escluso dall'analisi.Gli esperimenti non sono casuali.I ricercatori non erano ciechi rispetto ai compiti di gruppo durante l’esperimento.
Per ulteriori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'abstract del rapporto di ricerca sulla natura collegato a questo articolo.
I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili in Informazioni supplementari.Questo articolo fornisce i dati originali.
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